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TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的5'-3’外切核酸酶活性，切斷探針,產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合,所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和-條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合,其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，如FAM、VIC等 ，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q) ,如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收,儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行, Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針,其3'→5'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán),其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)(如下圖)。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段樣,有個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
SYBR Green I染料法
SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是-種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料(如下圖) 。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量k。 SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是:
1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。
2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。
3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。
4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。
如何做選擇：
SYBR Green熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合,對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性,所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果,對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下,本法是-種成本低廉的選擇。
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