實(shí)驗(yàn)簡介：
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)建于1907年，歷經(jīng)一個(gè)世紀(jì)磨練與升華，現(xiàn)已成為自然科學(xué)領(lǐng)域*的研究方法之一。小伙伴們要想在如今細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛滲透的科學(xué)研究領(lǐng)域搞好科研，最基礎(chǔ)的細(xì)胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇技術(shù)自然不能忽視。
細(xì)胞凍存是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，起到了細(xì)胞保種的作用。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.材料準(zhǔn)備：
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降溫機(jī)
2.冷凍方法理論準(zhǔn)備:
(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-8O℃16~18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽長期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-8O℃冰箱中。
(2）程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
實(shí)驗(yàn)步驟：
細(xì)胞凍存步驟：
1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍;
2.加入適量胰酶，置于培養(yǎng)箱中消化;
3.待消化到位后加入適量血清或*培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min;
4.配制凍存液，待細(xì)胞離心后去上清，加入凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107 cells/mL，轉(zhuǎn)移到凍存管中;
5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
6.凍存細(xì)胞后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存，
為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，再繼續(xù)凍存
注意事項(xiàng)
1.欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80~90%致密度。
冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
2.細(xì)胞在液氮中可長期凍存無*，而不會(huì)影響細(xì)胞活力﹔在-70度可保存數(shù)月。注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。
DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色是直接購買無菌產(chǎn)品，以5~10m1小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
3.凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠。無論再怎么小心，細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過程中總會(huì)死掉一批的。所以，一開始凍存細(xì)胞的數(shù)量要足夠。一般要達(dá)到5× 10^6 /毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個(gè)不能一概而論。有些細(xì)胞，比如雜交瘤細(xì)胞，只需要1-3x 10^6 /毫升
細(xì)胞復(fù)蘇
1.操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
2.自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。
3.將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.取出冷凍管，立即放入3℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以7O%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
5.取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15)，混合均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1m1解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。
6.解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。
惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10m1培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心 1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)
1.復(fù)蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來之后，迅速放在37°C水浴中，搖晃令其盡快融化。
2.解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會(huì)造成細(xì)胞生長不良，甚至死亡。
關(guān)于產(chǎn)品
CryoStor®是Biolife公司特別優(yōu)化的細(xì)胞凍存液，在極低溫度 (-70ºC to -196ºC)下準(zhǔn)備和保存細(xì)胞。預(yù)混DMSO，為細(xì)胞和組織的冷凍、儲(chǔ)存和解凍過程提供安全的保護(hù)環(huán)境。CryoStor®通過調(diào)控凍存過程的分子生物學(xué)反應(yīng)，無血清、蛋白或具有高細(xì)胞毒性的試劑，就能增強(qiáng)細(xì)胞活力和功能。
貨號(hào) 產(chǎn)品描述 規(guī)格
210210 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 1000mL/袋
210202 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 100mL/袋
210102 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 100mL/瓶
210374 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 16mL/瓶
210373 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 10mL/瓶
現(xiàn)貨供應(yīng)中，欲購從速。
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