介紹
可變長(zhǎng)度的DNA(DNA探針)能夠與互補(bǔ)的核酸鏈形成非共價(jià)、高度特異的雙鏈(稱為雜交)。當(dāng)一個(gè)標(biāo)簽附加到這樣一個(gè)雜交探針的檢測(cè)可以有效地服務(wù)于定義目標(biāo)DNA序列標(biāo)記DNA探針通常用于原位雜交實(shí)驗(yàn)研究和臨床診斷特定染色體的DNA序列,以及潛在的畸變(突變。缺失和/或重復(fù))被檢測(cè)到并定位在固定的組織和細(xì)胞內(nèi)。
原位DNA的可視化要么通過(guò)熒光讀數(shù)(熒光原位雜交(FISH))，要么通過(guò)顯色檢測(cè)(顯色原位雜交(CISH))，這依賴于酶促反應(yīng)導(dǎo)致有顏色的底物沉淀。
原位雜交中對(duì)DNA探針的標(biāo)記通常是使用標(biāo)記DNA聚合酶(=聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))或DNA酶I/ DNA聚合酶1的混合物(-NT)(表1)
表1原位雜交DNA探針可通過(guò)Nick Translation或PCR酶標(biāo)
| Nick Translation | PCR | |
| 原則 | DNA酶 I在dsDNA中引入隨機(jī)單鏈斷裂('nicks ')，隨后由DNA聚合酶I填充，使用標(biāo)記的dNTP作為其天然配對(duì)物的替代物 | 一段特定DNA的擴(kuò)增(用特定引物或多段DNA進(jìn)行PCR)利用Taq聚合酶摻入標(biāo)記的dNTP取代其自然對(duì)應(yīng)物的位點(diǎn)(用退化寡核苷酸引物進(jìn)行PCR (dopo -PCR)) |
| 模板 | 線性化的dsDNA的pmol量 | 線性化的dsDNa的fmol數(shù)量 |
| 標(biāo)記片段大小 | 100–500 bp dsDNA | up to 1500 bp |
| 擴(kuò)增 | 否 | 是 |
熒光dUTP & dCTP
熒光dUTP和dCTP可用于酶促標(biāo)記DNA探針一步完成。標(biāo)記后的DNA探針可通過(guò)熒光顯微鏡或光譜直接顯示。組合標(biāo)記，例如用不同或*的熒光團(tuán)標(biāo)記探針，允許同時(shí)顯示多個(gè)目標(biāo)(多路復(fù)用)41熒光團(tuán)的選擇取決于可用的激發(fā)源、濾光片組、應(yīng)用(單色或多色成像)(表2)和所需的酶標(biāo)技術(shù)(Nick Translation或PCR)(表3)。
熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性和親水性都是決策時(shí)需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)。例如，光穩(wěn)定性提高的熒光團(tuán)一般可以增加靈敏度，從而提高目標(biāo)序列的檢測(cè)極限。然而，熒光團(tuán)的親水性直接影響相應(yīng)標(biāo)記的dUTP和dCTP的基材性能用親水(如Cy3)或中度疏水染料(如德州紅)標(biāo)記的dUTP和dCTP是PCR和Nick翻譯標(biāo)記的理想選擇。相反，疏水熒光載體(如ATTO0647N)會(huì)導(dǎo)致DNA擴(kuò)增的提前終止，很可能是由于染料-dve或染料-酶的相互作用，因此僅推薦用于Nick Translation。
表2所選熒光染料的光譜特性。++:好，+:中等，-:poon請(qǐng)注意:呋酚的性能取決于呋酚的應(yīng)用，呋酚是親水性和光穩(wěn)定性之間的一種承諾，這分別決定了親水性和光穩(wěn)定性的親水性和檢測(cè)靈敏度。
表3酶合成的熒光dUTP和dCTP。n / a:不適用
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